CRISPR

 Ursprung

• CRISPR steht für Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats.

• Es ist ursprünglich ein bakterielles Immunsystem gegen Viren (Phagen).

• Bakterien schneiden Stücke von Virus-DNA heraus und speichern sie in ihrem Genom → „Gedächtnis“.

• Bei erneutem Virusbefall nutzt das Bakterium diese Sequenzen, um die virale DNA gezielt zu zerschneiden.

⚗️ Molekulare Komponenten

1. crRNA (CRISPR RNA)

   • Enthält eine Sequenz, die komplementär zur Ziel-DNA ist (die man bearbeiten will).

2. tracrRNA (trans-activating crRNA)

   • Verbindet crRNA mit dem Enzym Cas9.

   • In der Laborversion sind crRNA + tracrRNA meist als ein einziges Molekül zusammengebaut → sgRNA (single guide RNA).

3. Cas9-Protein (CRISPR-associated protein 9)

   • Eine Endonuklease, die die DNA schneidet.

   • Sie erkennt die RNA-Führungssequenz und bindet an das passende DNA-Stück.

4. PAM-Motiv (Protospacer Adjacent Motif)

   • Kurze DNA-Sequenz (z. B. „NGG“ für Cas9 aus Streptococcus pyogenes).

   • Notwendig, damit Cas9 die Zielstelle erkennt.

   • Ohne PAM kein Schnitt!

Mechanismus des CRISPR/Cas9-Verfahrens

1. Führung

   • Die sgRNA führt Cas9 an die DNA-Sequenz, die komplementär zur crRNA ist.

   • Basenpaarung: RNA–DNA-Hybrid entsteht.

2. Erkennung

   • Cas9 überprüft, ob direkt neben der Zielsequenz ein PAM-Motiv liegt.

   • Nur dann wird geschnitten → Sicherheitsmechanismus.

3. Doppeltstrangbruch (DSB)

   • Cas9 schneidet beide DNA-Stränge exakt 3 Basen neben dem PAM.

   • Es entsteht ein Doppelstrangbruch.

4. DNA-Reparatur durch die Zelle

   • Die Zelle muss den Bruch reparieren:

     • NHEJ (Non-Homologous End Joining): schnelle, fehleranfällige Reparatur → kleine Insertionen/Deletionen (Knock-out von Genen).

     • HDR (Homology Directed Repair): präzise Reparatur mithilfe einer bereitgestellten DNA-Vorlage → gezieltes Einfügen oder Austauschen von Sequenzen (Knock-in).

 

Anwendungen in der Medizin / Pharmazie

• Krebstherapie: Ausschalten von Onkogenen, Aktivierung von Tumorsuppressoren.

• Gentherapie: Korrektur von Mutationen (z. B. Sichelzellenanämie, β-Thalassämie).

• Infektionskrankheiten: Ausschalten von HIV-Provirus im Genom.

• Immuntherapie: Modifizierung von T-Zellen (z. B. CAR-T Herstellung mit CRISPR).

⚠️ Herausforderungen

• Off-Target-Effekte: Cas9 kann auch an ähnlich aussehende DNA-Stellen binden → ungewollte Mutationen.

• Effizienz von HDR: in vielen Zelltypen gering.

• Ethische Fragen: Keimbahneingriffe, Designerbabys.

Kurzform: CRISPR/Cas ist eine molekulare Schere, die durch eine RNA genau zu einer DNA-Stelle gelenkt wird. Dort schneidet Cas9 die DNA, und die Zelle repariert – entweder fehlerhaft (Knock-out) oder mithilfe einer Vorlage (Knock-in).